Иммунохемилюминесцентный анализ что это


Неизотопные методы иммунохимического анализа гормонов

Мы не случайно уделили так много внимания РИА.

.

Это был первый метод точного количественного определения гормонов, получивший широкое распространение и сыгравший огромную роль в лабораторной диагностике эндокринных нарушений. Именно на базе РИА сформировались современные принципы иммунохимического анализа гормонов. Однако за последние двадцать лет РИА был почти полностью вытеснен из клинической практики неизотопными методами иммунохимического анализа — ИФА и иммунохемилюминесцентным анализом. В основе этих методов, так же как и в основе РИА, лежит взаимодействие антигенов и антител, но в качестве метки используются не радиоактивные изотопы, а ферменты, катализирующие реакции с образованием окрашенного продукта, либо люминесцирующие вещества. В первом случае на конечном этапе анализа измеряют оптическую плотность реакционной смеси, во втором — количество квантов, испускаемых люминесцирующим веществом.

Иммуноферментный анализ

Для количественного определения гормонов чаще всего применяют твердофазный ИФА с двумя антителами. Его проводят в многолуночных пластиковых  планшетах. На дне лунок сорбированы моноклональные антитела, специфичные к определенной антигенной детерминанте гормона. В лунки вносят пробы сывороток с неизвестными концентрациями гормона либо стандартные образцы с известными концентрациями гормона. Планшет инкубируют 30—120 мин; за это время молекулы гормона успевают связаться с антителами, сорбированными на пластике. После инкубации лунки промывают буферным раствором для удаления несвязавшегося гормона и прочих компонентов сыворотки. Затем в лунки вносят поликлональные антитела к гормону, конъюгированные с пероксидазой (так называемый конъюгат), и инкубируют планшет 15—30 мин. При этом молекулы конъюгата связываются с молекулами гормона. Лунки вновь промывают для удаления несвязавшегося конъюгата и добавляют в них раствор, содержащий неокрашенный субстрат пероксидазы. Пероксидаза превращает этот субстрат в окрашенный продукт. Интенсивность окрашивания растворов в лунках (ее измеряют на фотометре) прямо пропорциональна количеству конъюгата в лунке, а оно — концентрации гормона. Концентрации гормона в пробах сывороток рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по результатам измерений концентраций гормонов в стандартных образцах.

Надо подчеркнуть, что эта методика ИФА, в отличие от описанной выше методики РИА, является неконкурентной. Дело в том, что в реакционной смеси отсутствует меченый антиген и уровень связывания поликлональных антител (конъюгата) с антигеном, сорбировавшимся на моноклональных антителах, зависит только от концентрации антигена в пробе. Неконкурентные методики применяются и при иммунохемилюминесцентном анализе.

Иммунохемилюминесцентный анализ

Существует множество вариантов иммунохемилюминесцентного анализа. Мы опишем типичный вариант, который применяется для измерения уровней гонадотропных гормонов в современных автоанализаторах. В этом варианте для связывания гормона используются парамагнитные микрочастицы, покрытые моноклональными антителами, высокоспецифичными к данному гормону. Микрочастицы суспендируют в буферном растворе и добавляют к суспензии пробы сывороток или стандартные образцы. После кратковременной инкубации (10— 20 мин) микрочастицы со связавшимся гормоном осаждают в магнитном поле и несколько раз промывают. Затем микрочастицы вновь суспендируют в буферном растворе, и добавляют к суспензии поликлональные антитела к гормону, конъюгированные со щелочной фосфатазой. После отмывки несвязавшегося конъюгата к суспензии микрочастиц добавляют диоксетина фосфат. Под действием щелочной фосфатазы из диоксетина фосфата образуется диоксетин, испускающий кванты люминесценции. Интенсивность люминесценции, которую измеряют с помощью фотоумножителя, прямо пропорциональна концентрации гормона в образце.

Методы выявления аутоантител

Нарушения репродуктивной функции могут быть прямо или косвенно обусловлены аутоиммунными патологиями. Например, мужское бесплодие может быть вызвано аутоиммунной реакцией против сперматозоидов, а в патогенезе женского бесплодия может играть роль аутоиммунное заболевание щитовидной железы или надпочечников. Маркерами аутоиммунных патологий служат аутоантитела. Для выявления сывороточных аутоантител (например, антифосфолипидных антител, антител к йодидпероксидазе или 21-гидроксилазе) применяют ИФА, иммунохемилюминесцентный анализ и метод непрямой иммунофлюоресценции. В последнем случае в качестве антигенного субстрата используют криостатные срезы ткани, против которой направлена аутоиммунная реакция. Для выявления антиспермальных антител в сперме и шеечной слизи применяют метод микроагглютинации с латексными частицами, покрытыми антителами к IgA или IgG.

Другие методы

Для некоторых гормонов, например катехоламинов и серотонина, непросто создать надежные методы иммунохимического анализа. Дело в том, что эти вещества имеют очень небольшую молекулярную массу и против них трудно получить высокоспецифичные первичные антитела, даже моноклональные. Такие же сложности возникают и при разработке методов иммунохимического анализа стероидных гормонов и их производных (из-за высокой вероятности перекрестных реакций первичных антител с разными стероидами, имеющими очень большое антигенное сходство). Поэтому для точного количественного анализа таких веществ в последнее время все чаще применяют жидкостную хроматографию высокого разрешения с последующей масс-спектрометрией.

Нередко эндокринные нарушения, в том числе и нарушения репродуктивной функции, бывают обусловлены не патологическими изменениями уровней гонадотропных или половых гормонов, а мутациями их рецепторов. Для оценки функции рецепторов ранее применялись биологические тесты in vitro: у больного брали биопсию ткани, являющейся мишенью данного гормона, помещали биоптат в культуральную среду, добавляли к среде гормон и оценивали реакцию ткани на этот гормон. В наши дни мутации рецепторов выявляют путем определения последовательности нуклеотидов ДНК в соответствующих генах. ДНК для таких анализов обычно получают из лимфоцитов больного.

www.sweli.ru

Иммуно – хемилюминесцентный анализ ИХЛА (CLIA). ИХЛА – современный метод лабораторной диагностики. В ИХЛА используется иммунологическая реакция, где в. - презентация

1 Иммуно – хемилюминесцентный анализ ИХЛА (CLIA)

2 ИХЛА – современный метод лабораторной диагностики. В ИХЛА используется иммунологическая реакция, где в качестве субстрата присоединяются люминофоры - вещества, светящиеся в ультрафиолете. Уровень свечения измеряется на специальных приборах ­люминометрах. Метод схожий с ИФА, но обладает большей специфичностью и чувствительностью, а также занимает меньше времени.

3 Принцип иммунохемилюминесцентного анализа

4 Awareness Technology Products биохимический фотометр Stat Fax® 1904 Chemistry Analyzer иммуноферментный анализатор StatFax 303+ иммуноферментный планшетный анализатор StatFax 3200 и многие другие….

5 стриповый ридер CLIA (стриповый люминометр) Первый стриповый ридер CLIA (Иммунохемилюминесцентный анализ - ИХЛА); Широкий диапазон и повышенная чувствительность; Открытая система для широкого спектра тестов СLIA; Экономичность, автообнуление, программирование пользователем; LCD дисплей; Встроенный термопринтер; Анализ трех стрипов в течение 1 мин; Программное обеспечение LumiCapture

6 стриповый ридер CLIA (стриповый люминометр) Технически характеристики Чувствительность/Определяемый уровень - пероксидаза хрена 1x щелочная фосфатаза 1x для других тестов исследуется Линейный динамический диапазон Перекрестная наводка менее 2,5 x 0,0001 Детектор фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) Спектральный диапазон чувствительности нм Пиковая длина волны 400 нм Метод детектеции люминесцентное свечение Тип стрипов одиночные, двойные или разделяемые стрипы, до 12 лунок, емкость загрузки - 36 лунок Формат каретки общий держатель стрипов может вмещать три 12-луночных стрипа или три 8-луночных стрипа Скорость измерение трех стрипов примерно за 1 минуту Клавиатура 16 мембранных клавиш, 4х4 Дисплей жидкокристаллический Встроенный принтер термический, точечная матрица, 20 знаков в строке Методы расчета многоточечная калибровка с кривыми регрессии или от-точки-к-точке, функция сохранения кривых, относительная единица света Последовательный порт только вывод, 9600 бод/с, 1 стартовый бит, 8 битов данных, 1 стоп-бит, без проверки на четность, без сигнала готовности Программное обеспечение - соединение между люминометром LumiStat и компьютером - передача результатов измерений в Excel - создание архива результатов - ПО включено в стандартный комплект поставки ??? Корпус пластиковый окрашенный огнеупорной эмалью с металлическим основанием Электропитание или В, 50/60 Гц, переключение по выбору - потребляемая мощность: менее 50 Вт - предохранители: два на 0.5 А, класс Т, 250В Температура, влажность °С, влажность менее чем 85% Габариты, вес 23 х 30 х 9 см, 5.9 кг

7 На каких реактивах работать???

8 О компании Monobind Monobind производит более 200 млн иммунологических реактивов ежегодно и является одним из самых больших производителей реактивов in vitro и экспертом в развитии иммунологического анализа.

9 О компании Monobind Производственные площади размером более м2 расположены в Lake Forest, California Производственный процесс 24 часа 7 дней в неделю гарантирует постоянно высокое качество продукции

10 О компании Monobind Усовершенствованные GMP и программа контроля качетства гарантируют высокое качество и надежность продукции, что подтверждено: Несколькими FDA Сертификатом ISO 13485:2003 и 9001:2000 Коммерческими премиями

11 Моnobind Inc

12 Функция щитовидной железы Трийодтиронин (T3) Трийодтиронин свободный (св.T3 – fT3) Тироксин (T4) Тироксин свободный (св.T4 – fT4) Тиреотропин (ТТГ – TSH) Трийодтиронин ультрачувствительный (Т3 ультра – T3U) Тиреоглобулин (ТГ –Tg) Тироксин-связывающий глобулин (ТСГ – TBG) T3, T4 и ТТГ (T3, T4 & TSH) Аутоиммунные заболевания щитовидной железы Антитела к Тиреоглобулину (Анти-ТГ – Anti-Tg) Антитела к Тиреопероксидазе (Анти-ТПО – Anti- TPO)

13 Микседематозный кретинизм в Конго (у трёх женщин лет – в нижнем ряду; сверху – здоровый ровесник).

14 Функция щитовидной железы у новорожденных Неонатальный Т4 (нТ4 – NT4) Неонатальный ТТГ (нТТГ – NTSH)

15 Моnobind ELISA Monobind CLIA T3T4ТТГT3T4ТТГ длительность чувствительно сть 0,4 нг/ мл 0,078 мкМЕ/ мл 0,2 нг/ мл 0,1 нг/ мл 0,2 мкМЕ /мл Сравнительная характеристика наборов

16 Фертильность Лютеотропин (ЛГ – LH) Фолликулостимулин (ФСГ – FSH) Пролактин (ПрЛ – PRL) Пролактин расширенный (ПЛ расш. – PRL Sequential) Хорионический гонадотропин (ХГЧ – hCG) ХГЧ, ПрЛ, ЛГ, ФСГ (hCG, PRL, LH, FSH)

17 Гормоны роста и надпочечники Соматотропин (СТГ – hGH) Кортизол (Cortisol)

18 Диабет Инсулин (Insulin) С-пептид (C-peptide)

19 Аллергия (Иммуноглобулин Е (IgE)

20 Анемия Ферритин (Ferritin)

21 Фото клеток при ЖДА и сходных гипохромных анемиях

22 Благодарю за внимание! СПАСИБО

www.myshared.ru

Иммуно – хемилюминесцентный анализ ихла (clia) ихла – современный метод лабораторной диагностики

НазваниеИммуно – хемилюминесцентный анализ ихла (clia) ихла – современный метод лабораторной диагностики
>В.О. Сухомлинський Вчитель - диригент учнівськог
Дата01.01.2013
Размер1.67 Mb.
ТипАнализ
    • Несколькими FDA
    • Сертификатом ISO 13485:2003 и 9001:2000
    • Коммерческими премиями
Разместите кнопку на своём сайте: rpp.nashaucheba.ru rpp.nashaucheba.ru rpp.nashaucheba.ru

rpp.nashaucheba.ru

Хемилюминесцентный иммунный анализ (ХЛИА)

Повысить чувствительность различных вариантов гетерогенного иммунного анализа позволяет замена хромогенных субстратов на флюоресцентные.

Измерение флюоресценции и хемилюминесценции возможно в широких пределах в отличие от фотометрии, которая ограничена измерением оптической плотности в пределах двух единиц. Это обстоятельство дало толчок к развитию и широкому внедрению этих методов в исследовательскую практику.

Хемилюминесцентная метка отвечает основным требованиям, предъявляемым к маркеру, наиболее важными из которых являются стерильность, доступность, высокая чувствительность регистрации, низкий уровень фоновых реакций, простота измеряющей аппаратуры, возможность регуляции активности маркера.

Кроме того, важно отметить небольшой период выхода регистрируемого сигнала на стационарный уровень и длительность стационарного периода.

Материалы и оборудование. 1. Полистироловые измерительные кюветы (пробирки) (например, фирмы Clinicon). 2. Полистироловые матовые планшеты для ХЛИА (Dynatech Micro FLUOR Systems). 3. Люминометр 1250 LKB для измеренения хемилюминесценции в кюветах. Люминометр AM-141 Dynatech для проведения измерения в планшетах. 4. Пипетки автоматические на 100 и 200 мкл. 5. Шприц непрерывного действия. 6. Флаконы на 500, 200 и 100 мл. 7. Пипетки 1; 2; 5 мл. 8. Пробирки бактериологические. 9. Термостат. 10. Холодильник. 11. Иммунные сыворотки против тех возбудителей, которых собираются выявить (желательно моноклональные), в рабочем разведении. 12. Протеин А, меченный пероксидазой (в рабочем разведении). 13. Бычий сывороточный альбумин. 14. Перекись (пероксид) водорода (30%-я). 15. Люминол. 16. n-Иодфенол. 17. Твин-20. 18. Нитроцеллюлозные фильтры или пленка.

Приготовление ингредиентов. Раствор № 1. 0,1 М ФБР (pH 7,2…7,4) содержит: 1,425 г сульфата натрия двузамещенного водного, 0,2 г сульфата калия однозамещенного, 3 г хлорида натрия, 0,2 г хлорида калия. Готовят растворением смеси солей в 500 мл дистиллированной воды с последующим доведением объема до 1000 мл; хранят не более 1 мес при 4 °С:

раствор № 1 а. К 100 мл раствора № 1 добавляют 0,05 мл Твина-20 и получают раствор для разведения исследуемого материала. Хранению не подлежит;

раствор № 1 б. В 100 мл раствора № 1 растворяют 0,5 г БСА, вносят 0,05 мл детергента и получают раствор для разведения конъюгата (КГ). Раствор не хранят.

Раствор №2. Трис-HCl буфер 0,1 М (pH 8,6) смешивают из расчета 25 мл 0,1 М трис (12,11 г трис-оксиметил-аминометана растворяют в 1000 мл дистиллированной воды и 6,2 мл 0,1 М НСl). Хранят не более 1 мес при 4 °С.

Раствор №3. 0,05 М КББ (pH 9,5…9,6) содержит: 0,59 г карбоната натрия и 1,73 г гидрокарбоната натрия. Готовят растворением смеси солей в 500 мл дистиллированной воды. Хранят не более 1 мес при 4 °С.

Раствор №4 (для отмывания). К 2000 мл дистиллированной воды добавляют 17,8 г NaCl. Перед употреблением вносят 0,05 % детергента. Хранению не подлежит.

Раствор №5. Иммуноглобулин (ИГ) разводят раствором № 3. Предназначен для сенсибилизации твердой фазы. Хранению не подлежит.

Раствор № 6. Конъюгат разводят до рабочего титра в растворе № 1 б. Хранению не подлежит.

Раствор №7. Субстратная смесь 1,25 мМ люминола, 2,7 мМ Н2O2 и 68 мМ параиодфенола в 0,1 М трис-HCl буфера (pH 8,6). Для этого необходимо приготовить три отдельных раствора:

раствор № 7 а. 5 мг люминола растворяют в 0,5 мл 0,05 М трис-HCl буферного раствора (pH 8,6). Хранят в холодильнике при 4 °С в темной посуде;

раствор № 7 б. 5 мг n-иодфенола растворяют в 5,5 мл 0,05 М трис-HCl буферного раствора (pH 8,6). Хранят в холодильнике в темной посуде;

раствор № 7 в. 0,1 мл пергидроля растворяют в 30 мл 0,05 М трис-HCl буфера (pH 8,6). Хранят 2 нед.

Субстратную смесь готовят непосредственно перед применением. Для этого смешивают по 0,5 мл растворов 7 а, 7 б, 7 в. Общий объем доводят до 10 мл 0,05 М трис-HCl буферным раствором.

Подготовка материала к исследованию. Исследованию в ХЛИА подлежат культуры возбудителей инфекционных заболеваний, объекты с посевами, а также материал от больных животных и людей.

Посевы выращивают на оптимальных средах при 37 °С в течение 1…2 сут. Приготавливают смыв с агара плотной средней густоты 1 ∙ 107 м. т./мл и добавляют 1%-й формалин для обеззараживания.

Сыворотки от больных обезвреживают мертиолатом натрия 1 : 10 000 с последующим прогреванием при 56 °С в течение 30 мин. Кровь, пунктаты, внутренние органы, биопробы обеззараживают 1%-м формалином и выдерживают не менее 12 ч при комнатной температуре.

Проведение анализа. Выявление бактериальных антигенов. 1. В лунки планшетов или измерительных кювет вносят с помощью автоматической пипетки 100 мкл раствора № 5.

2. Сорбцию на планшетах и кюветах иммуноглобулина проводят в течение 18…24 ч при 4 °С.

3. Через 24 ч содержимое удаляют из лунок и отмывают твердую фазу трехкратно по 3 мин раствором № 4. Вытряхивают жидкость из планшетов, высушивают на воздухе в течение 3…5 мин.

4. В опытные кюветы и лунки помещают при помощи автоматической пипетки 100 мкл взвеси обезвреженных микроорганизмов или исследуемый материал.

5. Планшеты и кюветы выдерживают в термостате при 37 °С в течение 2 ч при использовании планшетов и 18…24 ч при использовании кювет.

6. После экспозиции антиген из лунок удаляют и отмывают, как указано в п. 3.

7. В опытные и контрольные лунки вносят по 10 мкл раствора № 6 в рабочем разведении.

8. Планшеты и кюветы выдерживают в термостате при 37 °С в течение 1…2 ч.

9. Удаляют конъюгат из лунок и отмывают, как указано в п. 3.1.3, но кратность отмывания увеличивают до 5 раз.

10. В каждый резервуар планшета или кюветы вносят субстратную смесь (в опытные и две контрольные).

11. В опытных рядах, где прошла реакция, возникает эмиссия, которая регистрируется люминометром в микровольтах (mV) (отклонение стрелки на шкале прибора).

12. Контроли:

а) контроль конъюгата (К1) — постановка в описанной последовательности, но вместо антигена вносят раствор № 1. Контроль отрицательный;

б) контроль субстратной смеси (К2) — постановка в описанной последовательности, но вместо конъюгата вносят раствор № 1 б. Контроль отрицательный.

Обнаружение специфических антител. 1. В лунки планшетов или кюветы вносят по 100 мкл раствора соответствующего антигена или микробную взвесь в концентрации 1 ∙ 109 м. т./мл.

2. Сорбцию на твердую фазу осуществляют в течение 18…24 ч при 4 °С.

3. После указанной экспозиции антиген удаляют из лунок и отмывают носитель трехкратно по 3 мин раствором № 4. Затем удаляют буферный раствор и высушивают на воздухе 3…5 мин.

4. В опытные лунки вносят по 100 мкл исследуемого патматериала (кровь, сыворотка или смыв из грудной полости).

5. Планшеты или кюветы выдерживают при 37 °С в течение 2…4 ч.

6. После этого материал удаляют и отмывают, как указано в и. 3.

7. В опытные лунки и одну контрольную закапывают по 100 мкл рабочего раствора конъюгат-протеин А-пероксидазы (раствор № 6).

8. Пробирки или планшеты выдерживают при 37 °С в течение 2 ч.

9. Конъюгат удаляют и отмывают раствором № 4 пятикратно по 3 мин.

10. В каждую лунку, в том числе в контрольные, вносят субстратную смесь.

11. Контроли:

а) контроль конъюгата (К1) — ХЛИА ставится описанным способом, но вместо патматериала исследуют раствор № 1 а. Контроль отрицательный;

б) контроль субстратной смеси (К2) — реакцию ставят в описанной последовательности, но вместо конъюгата в лунку вносят раствор № 1 б. Контроль отрицательный.

12. Учет результатов. Реакция учитывается при помощи люминометра. Регистрируют величину интенсивности свечения в лунках планшета или кювете в условных единицах (mV). Разница в показаниях между опытными и контрольными лунками должна быть не менее чем в 4 раза.

В резервуарах, в которые внесли соответствующие антигены, показатели прибора составляют десятки микровольт. В резервуарах, в которые вместо антигена внесли раствор № 1 а, показатели прибора остаются низкими (К1).

В лунках, в которые внесли раствор № 1 б, реакция не происходит (К2).

Система реакции считается специфически положительной при наличии выраженной разницы между опытными и контрольными показателями не менее чем в 4 раза.

Хемилюминесцентная детекция ДОТ-анализа

Нитроцеллюлозные фильтры (d=5 см) с обработанными пробами после заключительного отмывания помещают на дно полистироловых кювет и вносят субстратную смесь. Пробы помещают в кюветах отделения люминометра и учитывают результаты, как указано выше.

Практическое использование. При использовании ХЛИА и ТИФА для лабораторной диагностики зооантропонозов оказалось, что ХЛИА несколько чувствительнее ТИФА (на один порядок). Для сравнения чувствительности и специфичности ХЛИА с общепринятыми серореакциями (А. Т. Яковлева и др., 1990) использовали представительную коллекцию микроорганизмов, включающую свыше 150 штаммов.

Все проверенные в ХЛИА штаммы В. mallei, В. pseudomallei дали положительный результат в отличие от 25 близкородственных псевдомонад. При исследовании коллекции сибиреязвенных бацилл в ХЛИА наблюдали единичные ложноположительные результаты с В. subtilis, В. mycoides. По-видимому, при использовании более специфичных ПИК эти недостатки будут устранены.

Из 17 исследованных штаммов бруцелл и близкородственных микроорганизмов только с Y. enterocolitica 09 была зарегистрирована положительная реакция, что подтверждает давно установленный факт наличия антигенных связей между бруцеллами и иерсиниями.

ХЛИА был успешно применен в иммунодиагностике для исследования различного экспериментального и полевого патологического материала на присутствие специфических антигенов.

По эффективности обнаружения специфических антигенов ХЛИА несколько превышает РИГА и даже ТИФА.

ХЛИА оказался непригоден для исследования объектов окружающей среды (почвы, воды, смывов и др.) из-за фоновых помех, поэтому для индикации его использовать не следует.

При исследовании 503 образцов крови диких грызунов на наличие противочумных антител положительные результаты в ХЛИА получены в 11 случаях, в ТИФА — в 9. В этих тестах исследованы мелиоидозные антитела из сывороток 54 зараженных золотистых хомячков. Выявлено 50 и 48 серопозитивов. При анализе на антиген материала от 41 больного бруцеллезом находки составили в ХЛИА 35 и в ТИФА 31, от 96 работников мясокомбината — 61 и 53 соответственно.

Таким образом, ХЛИА можно использовать для иммунодиагностики бактериальных особо опасных инфекций.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Вконтакте

Facebook

Twitter

Google+

Одноклассники

www.activestudy.info


Смотрите также